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Dénombrement microbiologique sur milieu liquide

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Le dénombrement microbiologique sur milieu liquide est une technique de dénombrement permettant de déterminer la quantité de micro-organismes du type recherché par quantité d'échantillon analysé. Il est utilisé pour déterminer la quantité de germes pathogènes ou indicateurs présents dans un échantillon. La plupart du temps cette technique est utilisée pour analyser des produits liquides ou des produits solides broyés. Cette technique consiste en l'ensemencement de nombreux tubes de bouillon à partir de dilutions décimales successives de l'échantillon.

La présence des micro-organismes recherchés est mise en évidence en général par l'obtention d'un trouble éventuellement associé à des changements du milieu (production de gaz, changement de couleur...) caractéristiques de ce type de micro-organismes. Ensuite, l'exploitation des résultats se fait à l'aide de l'association de chaque résultat relevé sur chaque tube. Cette lecture donne un chiffre interprétable aboutissant à une quantité de micro-organismes présents ou non dans la matrice initiale « unité formant trouble » (UFT).

Cette technique est classiquement utilisée pour le dénombrement des coliformes totaux et fécaux en milieux BLBVB.

« Nombre le Plus Probable »

Tout d'abord, afin de vérifier la présence d'un ou de plusieurs micro-organismes dans une matrice, il faut effectuer une gamme de dilution allant de 100 (suspension mère) à une dilution assez importante qui soit significative. Ensuite, il faut ensemencer un milieu sélectif en fonction de l'espèce à isoler. Un résultat positif (+) correspond à un trouble ou une production de gaz au sein du tube alors qu'un résultat négatif (-) signifie qu'il n'y a eu aucune croissance dans le tube.

Principe général

Il faut donc reporter dans un tableau les différents résultats obtenus avec les + et les -. Lorsque le résultat des tests montre un passage de positif à négatif, la concentration en micro-organismes dans le milieu initial est comprise entre les dilutions ou le test est positif en dernier et celui où il est négatif en premier.

Exemple de tableau
Volume de l'inoculum Produit pur 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Résultats + + + + - - -

La concentration en bactérie dans la matrice est donc comprise entre 103 et 104 UFC/mL. Lorsque tous les résultats sont positifs, la concentration en micro-organismes sera donc de l'inverse de la plus grande dilution effectuée en UFC/mL. Au contraire, lorsqu'il n'y a que des résultats négatifs, la concentration en micro-organismes est inférieur à 1 UFC/mL

Méthode de NPP (Table de Mac Grady)


Deux tubes par dilutions

Il faut donc ensemencer deux tubes pour chaque dilution. La méthode du NPP (Nombre le Plus Probable), consiste à interpréter les résultats en fonction de la position et du nombres de tubes positifs. Après incubation, noter pour chaque essai si le résultat est positif ou négatif. Pour chaque dilution, affecter un chiffre égal à la somme des tubes positifs.

Dilution 100 10-1 10-2 10-3 10-4
Résultats +/+ +/+ +/+ +/+ -/-
Chiffre attribué 2 2 2 1 0

Afin de déduire un paramètre statistique de se tableau, il faut choisir une suite de 3 chiffres consécutifs donnant un nombre inférieur à 220 (meilleure répartition dans les dilutions). Ensuite, la table de Mac Grady permet de lire le NPP pour 2 tubes par dilution.

Nous pouvons donc déduire la concentration en micro-organismes par mL de produit pur C :

<math display="block">C = \frac{NPP}{V_{inoculum} . d}</math>

Dans le cas de l'exemple, on choisit 210 (car < 220) pour la dilution 10-2 Dans la table de Mac Grady, le NNP correspondant à 210 est 6,0. C = 6,0.102 UFC/mL.

Trois tubes par dilutions

Dilution 100 10-1 10-2 10-3 10-4
Résultats +/+/+ +/+/+ +/+/- +/-/- -/-/-
Chiffre attribué 3 3 2 1 0

Afin de déduire un paramètre statistique de se tableau, il faut choisir une suite de 3 chiffres consécutifs donnant un nombre inférieur à 330 (meilleure répartition dans les dilutions). Ensuite, la table de Mac Grady permet de lire le NPP pour 3 tubes par dilution. Dans le cas de l'exemple, on choisit 321 (car < 330) pour la dilution 10-1. Dans la table de Mac Grady, le NNP correspondant à 321 est 15. C = 15.101 = 1,5.102 UFC/mL.

Sources

  • Techniques de dénombrement, C.LARCHER[1]
  • Dénombrement sur milieu solide et liquide, Académie de Montpellier [2]
    Dictionnaire des techniques Microbiologie Tome 1 Jean-Noel Joffin – Guy Leyral[3]
  • Fanny Demay – BTS BioAnalyses & Contrôles [4]
  • Bactériologie des eaux, Toxikoa [5]

Références

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